最近很多人都在严峻，自己的国家自然科学青年基金是否能中！我觉得很古怪，一个国家自然科学青年基金莫非还中不了吗？一个博士结业的人，凡是有点真知灼见的，凡是有必定的研讨根底的、凡是有几篇拿得出手的代表性论文、连熟人都不必找，青年基金都应该稳中，有什么好忧虑和严峻的？青年基金=博士期间研讨根底+簿本质量，面上项目=本范畴内的研讨根底+簿本质量+人脉。有人快35岁了，还在忧虑青年基金本年能不能中，我也是醉了。那这个博士也太水了吧！我不知道他博士学位是怎样拿到的，博士结业之后这几年又是怎样混的。来历：【中国科学院】

CRISPR-Cas13是一类由RNA介导的靶向RNA的基因修改技能。Cas13蛋白归于2类VI型多结构域单一蛋白RNA内切酶。体外研讨标明Cas13蛋白激活后具有切开靶RNA的功用，并能对其周围的恣意RNA（bystander RNA）进行非特异性地切开，这一特性用于开发RNA检测。2015年报导Cas13a(c2c2)以来，国内外报导了一批CRISPR-Cas13体系（Cas13b/c/d/X/Y/bt），并证明了其能够在哺乳动物细胞中对靶RNA进行高效且特异性地敲低。相较于Cas9介导的DNA修改技能，根据Cas13的RNA修改东西靶向动态转录的RNA，不会对基因组形成永久性改动，且能够经过剂量调整等办法操控RNA修改作用，具有可逆性，相对来说更安全。

但是，越来越多的依据标明，Cas13a、Cas13b、Cas13d等在哺乳动物细胞中普遍存在旁切活性（collateral activity），会形成严峻的脱靶效应。最新的研讨标明，Cas13（特别是Cas13d）对动物细胞和个别发生都会形成较大的毒副作用。因而，Cas13蛋白自身普遍存在的旁切活性已成为其走向临床使用的妨碍，怎么下降或消除Cas13蛋白的旁切活性显得尤为必要，开发更特异的高保真Cas13蛋白对根据RNA修改的基因治疗战略研制及后续的临床转化具有重要意义。

8月11日，Nature Biotechnology在线宣布了题为High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects的研讨论文。该研讨由中国科学院脑科学与智能技能杰出立异中心（神经科学研讨所）、神经科学国家要点试验室、中科院灵长类神经生物学要点试验室、上海脑科学与类脑研讨中心杨辉研讨组等协作完结。该研讨归纳使用蛋白质工程、流式细胞术、体外切开试验、全转录组测序、转基因小鼠、在体基因治疗安全性验证等技能手法，对Cas13（包含Cas13d和Cas13X）进行蛋白工程化改造、挑选及验证，开发出具有高效修改活性但极低旁切活性的高保真Cas13蛋白变体。本研讨对根据RNA修改的根底科学研讨、基因治疗战略研制以及后续的临床转化具有重要意义。

研讨开发了根据绿色荧光蛋白（EGFP）和赤色荧光蛋白（mCherry）的双荧光陈述体系，用于在哺乳动物细胞中检测Cas13蛋白的旁切效应。研讨经过靶向敲低一种荧光蛋白（如mCherry）的mRNA，检测别的一种荧光蛋白（如EGFP）的表达水平，发现Cas13a与Cas13d蛋白的激活都能诱导出明显的旁切效应。为了下降或消除Cas13d蛋白的旁切活性，研讨猜测并比照剖析了Cas13d的蛋白结构。现在，已报导的Cas13宗族成员均带有2个标志性的HEPN结构域，其上的RxxxxH保存基序是Cas13核酸酶催化活性位点。当Cas13蛋白与gRNA结合其核酸酶活性被激活后，该催化活性位点会暴露在蛋白外表，继而对周围的RNA进行无差别的切开。

研讨使用蛋白质工程手法对Cas13d蛋白进行一系列的骤变改造，以改动Cas13d蛋白与非靶RNA的相互作用，并归纳使用哺乳动物细胞转染、流式细胞术等办法，挑选获得了一些具有高效修改活性但旁切活性明显下降的Cas13d蛋白变体，其间Cas13d-N2V8变体归纳表现出最好的特异性，具有最高保真性（high-fidelity Cas13d，hfCas13d）。研讨对很多内源基因位点进行RNA敲低的试验发现，hfCas13d表现出与野生型Cas13d相同的高活性。研讨运用体外切开试验、全转录组剖析、稳转细胞系、转基因小鼠、在体靶向RNA敲降等技能，对hfCas13d进行体系性的脱靶效应验证及安全评价。归纳而言，该作业开发出具有高效修改活性但极低旁切活性的高保真Cas13d蛋白变体。这一新东西显示出更高特异性，且在基因治疗方面具有更好的安全性。

2021年，脑智杰出中心杨辉研讨组在Nature Methods上报导了现在最小的RNA修改东西Cas13X体系（仅775个氨基酸）。本作业在此根底上进一步开发出具有高效修改活性但极低旁切活性的高保真Cas13X蛋白变体（hfCas13X），将在根据RNA修改的基因治疗范畴显示出使用潜力。

研讨作业得到国家自然科学基金、科技部、上海市、中科院和临港试验室的支撑。

图1.高保真Cas13蛋白的工程化规划、挑选及脱靶效应验证

图2.高保真Cas13蛋白在哺乳动物细胞及个别中有效性及安全性的评价

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